Nhuộm Gram là một kỹ thuật nhanh chóng và được sử dụng để xem sự hiện diện của vi khuẩn trong một mẫu mô và phân loại vi khuẩn là Gram dương hoặc Gram âm, dựa trên các đặc tính hóa học và vật lý của thành tế bào của chúng. Nhuộm Gram hầu như luôn được sử dụng như bước đầu tiên để chẩn đoán nhiễm trùng do vi khuẩn.
Kỹ thuật nhuộm này được đặt theo tên nhà khoa học Đan Mạch Hans Christian Gram (1853 - 1938), người đã phát triển kỹ thuật này vào năm 1882 và công bố năm 1884 như một kỹ thuật phân biệt giữa hai loại vi khuẩn có triệu chứng lâm sàng giống nhau: Streptococcus pneumoniae (còn được gọi là Streptococcus pneumoniae). Phế cầu) và vi khuẩn Klebsiella pneumoniae.
Bươc chân
Phương pháp 1/3: Chuẩn bị Trang trình chiếu Kính hiển vi
Bước 1. Chuẩn bị làm việc trong phòng thí nghiệm
Mang găng tay và dây buộc tóc dài để tránh nhiễm vi khuẩn cho mẫu bạn đang thử nghiệm. Làm sạch không gian làm việc dưới tủ hút, hoặc trong một khu vực thông gió tốt khác. Kiểm tra đầu đốt Bunsen và đảm bảo kính hiển vi hoạt động bình thường trước khi bạn bắt đầu.
Bước 2. Khử trùng lam kính của kính hiển vi
Nếu lam kính bị bẩn, hãy rửa bằng nước xà phòng để loại bỏ dầu và bụi bẩn. Làm sạch các phiến kính bằng etanol, nước rửa kính hoặc phương pháp khác mà phòng thí nghiệm của bạn sử dụng.
Bước 3. Đặt mẫu lên lam kính
Bạn có thể sử dụng kỹ thuật nhuộm Gram để giúp xác định vi khuẩn trong mẫu y tế hoặc nuôi cấy vi khuẩn phát triển trong đĩa petri. Để có kết quả tốt nhất, sử dụng nhuộm Gram trên các nét mỏng của mẫu. Nên sử dụng các mẫu có tuổi đời dưới 24 giờ, vì vi khuẩn cũ hơn có thể đã làm hỏng thành tế bào của chúng và có thể không đáp ứng với nhuộm Gram.
- Nếu sử dụng mẫu khăn giấy, hãy nhỏ 1-2 giọt vào lam kính. Trải đều trên phiến kính để tạo thành một lớp mỏng rắc mẫu, bằng cách dùng mép của phiến kính vô trùng khác trượt nó. Để khô trước khi thực hiện bước tiếp theo.
- Nếu bạn đang lấy vi khuẩn từ đĩa petri, hãy khử trùng vòng cấy trong lò đốt Bunsen cho đến khi nó phát sáng, sau đó để nguội. Dùng que cấy để nhỏ nước vô trùng lên phiến kính, sau đó khử trùng và làm nguội lại trước khi sử dụng để lấy một mẫu vi khuẩn nhỏ. Sau đó khuấy nhẹ.
- Vi khuẩn đã chuẩn bị trong nước dùng phải được khuấy lại bằng máy xoáy, sau đó lấy vòng cấy như trên, không cần thêm nước.
- Nếu bạn có mẫu tăm bông (thường được làm bằng tay cầm có đầu bông nhỏ), hãy chạm và xoay nhẹ tăm bông trên phiến kính.
Bước 4. Nhiệt độ hơi cao có thể tạo ra vết bẩn tốt
Nhiệt sẽ giữ các vi khuẩn ở trên phiến kính, vì vậy chúng không dễ dàng hòa tan trong quá trình nhuộm. Chạm nhanh vào slide từ hai đến ba lần trên đầu đốt Bunsen hoặc làm nóng slide trên lò sưởi trượt điện. Không quá nóng, mẫu có thể bị hỏng. Nếu bạn đang sử dụng đầu đốt Bunsen, nó phải là ngọn lửa nhỏ nhưng có màu xanh lam thay vì ngọn lửa màu cam lớn.
Ngoài ra, cũng có thể tạo vết bẩn bằng metanol, bằng cách thêm 1-2 giọt metanol vào vết bẩn khô, làm khô metanol còn lại trên phiến kính bằng cách để ngoài không khí. Kỹ thuật này giảm thiểu tổn thương tế bào và cung cấp nền hình ảnh trang chiếu sạch sẽ
Bước 5. Đặt slide trên khay màu
Khay nhuộm được làm bằng kim loại, thủy tinh hoặc đĩa nhựa nông với một lớp lưới mềm phía trên. Đặt các tấm trượt lên trên những tấm lưới này để chất lỏng bạn sử dụng có thể được thoát vào khay.
Nếu không có khay tạo màu, bạn có thể đặt lam trên khay nhựa để in đá viên
Phương pháp 2/3: Quy trình Gram Stain
Bước 1. Đổ chất lỏng màu tím pha lê lên vết bẩn
Dùng pipet để phun vào mẫu vi khuẩn một vài giọt thuốc nhuộm màu tím pha lê, còn được gọi là màu tím gentian. Để nó trong 30-60 giây. Tinh thể tím (KV) phân tách trong dung dịch nước thành các ion KV + và clorua (Cl-). Các ion này xâm nhập vào thành tế bào và màng tế bào của cả vi khuẩn gram dương và gram âm. Ion KV + tương tác với các thành phần mang điện tích âm của tế bào vi khuẩn, làm cho tế bào có màu tím.
Nhiều phòng thí nghiệm sử dụng màu tím pha lê "Hucker", có chứa amoni oxalat để ngăn kết tủa
Bước 2. Nhẹ nhàng rửa sạch Crystal violet
Nghiêng phiến kính và sử dụng bình rửa để phun một dòng nước cất hoặc nước máy nhỏ lên phiến kính. Nước phải chảy xuống bề mặt vết bẩn và không nên phun trực tiếp lên vết bẩn. Không rửa quá mức. Nó có thể loại bỏ vết ố ở vi khuẩn Gram dương.
Bước 3. Rửa sạch vết bẩn bằng i-ốt, sau đó rửa sạch
Dùng ống nhỏ giọt để rửa vết bẩn bằng i-ốt. Để nguyên trong ít nhất 60 giây, sau đó rửa sạch cẩn thận theo cách tương tự như trên. Iốt, ở dạng ion tích điện âm, tương tác với KV + để tạo thành phức hợp chất lớn giữa tinh thể tím và iốt (phức hợp CV-I) ở lớp trong và lớp ngoài của tế bào. Hợp chất phức hợp này sẽ giữ lại màu tím của tinh thể tím bên trong tế bào, tại các vị trí bị nhuộm màu.
Iốt là một chất ăn mòn. Tránh hít phải, nuốt phải hoặc tiếp xúc với da
Bước 4. Thêm thuốc tẩy màu, sau đó rửa sạch nhanh chóng
Hỗn hợp 1: 1 gồm axeton và etanol thường được sử dụng cho bước quan trọng này, bước này phải được canh thời gian cẩn thận. Định vị phiến kính ở một góc nhất định, sau đó thêm thuốc tẩy màu cho đến khi không còn thấy màu tím trong nước rửa. Quá trình này thường mất chưa đến 10 giây, hoặc thậm chí ít thời gian hơn nếu thuốc tẩy có nồng độ axeton cao. Dừng bước này ngay lập tức, nếu không thuốc nhuộm cũng sẽ làm trôi màu tím tinh thể từ các tế bào gram dương và âm tính, và quá trình nhuộm phải được lặp lại. Rửa sạch ngay chất tẩy màu thừa bằng kỹ thuật trước đó.
- Axeton nguyên chất (95% +) có thể dùng thay thế, càng dùng nhiều axeton thì thuốc tẩy càng nhanh nên bạn cần chú ý thời gian hơn.
- Nếu bạn gặp khó khăn trong việc theo dõi thời gian cho bước này, hãy thêm từng giọt thuốc tẩy màu.
Bước 5. Rắc thuốc nhuộm lên vết bẩn, sau đó rửa sạch
Thuốc nhuộm màu, thường là safranin hoặc fuchsin, được sử dụng để tăng độ tương phản giữa vi khuẩn gram âm và gram dương, bằng cách nhuộm vi khuẩn đã khử màu (đã khử màu), tức là vi khuẩn gram âm, có màu hồng hoặc đỏ. Để ít nhất 45 giây, sau đó rửa sạch.
Fuchsin sẽ nhuộm nhiều vi khuẩn gram âm, chẳng hạn như Haemophilus spp và Legionella spp. Phương pháp này tốt cho người mới bắt đầu
Bước 6. Làm khô slide
Bạn có thể phơi chúng ngoài trời cho khô, hoặc làm khô chúng bằng cách sử dụng giấy bibulous được bán cho mục đích này. Quá trình nhuộm Gram đã hoàn tất.
Phương pháp 3/3: Kiểm tra kết quả tô màu
Bước 1. Chuẩn bị kính hiển vi ánh sáng
Đặt phiến kính dưới kính hiển vi. Vi khuẩn có kích thước rất khác nhau, vì vậy tổng độ phóng đại cần thiết sẽ thay đổi từ 400x đến 1000x. Nên sử dụng vật kính với dầu ngâm để có hình ảnh sắc nét hơn. Nhỏ dầu ngâm lên phiến kính, tránh di chuyển trong khi nhỏ giọt để tránh hình thành bong bóng. Di chuyển tay cầm của ống kính hiển vi để vật kính bắt vào vị trí và chạm vào dầu.
Ngâm dầu chỉ có thể được sử dụng trên ống kính được thiết kế đặc biệt, không được sử dụng trên ống kính "khô"
Bước 2. Cố gắng xác định vi khuẩn gram dương và gram âm
Kiểm tra phiến kính dưới kính hiển vi ánh sáng. Vi khuẩn Gram dương có màu tím do tinh thể tím bị mắc kẹt trong thành tế bào dày. Vi khuẩn Gram âm sẽ có màu hồng hoặc đỏ, do màu tím pha lê được tráng qua thành tế bào mỏng, nơi thuốc nhuộm màu hồng xâm nhập vào.
- Nếu mẫu quá đặc, kết quả có thể là dương tính giả. Hãy nhuộm một mẫu mới nếu nó cho thấy tất cả các vi khuẩn gram dương, để đảm bảo kết quả là chính xác.
- Nếu bạn sử dụng quá nhiều thuốc tẩy màu, kết quả có thể là âm tính giả. Hãy nhuộm một mẫu mới nếu nó cho thấy toàn bộ vi khuẩn gram âm, để đảm bảo kết quả là chính xác.
Bước 3. So sánh kết quả bạn thấy với hình ảnh tham khảo
Nếu bạn không biết vi khuẩn trông như thế nào, hãy nghiên cứu bộ sưu tập các hình ảnh tham khảo, thường được sắp xếp theo hình dạng và nhuộm Gram. Bạn cũng có thể xem cơ sở dữ liệu trực tuyến tại [Cơ sở dữ liệu quốc gia về mầm bệnh vi sinh vật, vi khuẩn trong ảnh, và nhiều trang trực tuyến khác. Để thuận tiện cho việc xác định, dưới đây là các ví dụ về vi khuẩn thường gặp hoặc quan trọng để chẩn đoán, được phân loại theo tình trạng và hình dạng Gram của chúng.
Bước 4. Xác định vi khuẩn gram dương dựa trên hình dạng của chúng
Vi khuẩn được phân loại sâu hơn theo hình dạng của chúng dưới kính hiển vi, phổ biến nhất là cầu khuẩn (hình cầu) hoặc hình que (hình trụ). Dưới đây là một số ví dụ về vi khuẩn gram dương (màu tím) theo hình dạng của chúng:
- Cầu khuẩn gram dương thường là tụ cầu (có nghĩa là cầu khuẩn nhóm) hoặc liên cầu (có nghĩa là cầu khuẩn chuỗi).
- 'Các que Gram dương như Bacillus, Clostridium, Corynebacterium và Listeria. Vi khuẩn que Actinomyces spp. thường có cành hoặc dạng sợi.
Bước 5. Xác định vi khuẩn gram âm
Vi khuẩn gram âm (có màu hồng) thường được phân thành ba nhóm. Cocci có dạng hình cầu, que dài và mỏng, trong khi các que coccoid ở giữa.
- Cầu khuẩn gram âm Phổ biến nhất là Neisseria spp.
- Que gram âm ví dụ: E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, và nhiều loại khác. Vibrio cholerae có thể được nhìn thấy như một thân cây thông thường hoặc một thân cây uốn cong.
- Vi khuẩn que "coccoid" (hoặc "coccobacilli") Gram âm ví dụ: Bordetella, Brucella, Haemophilus và Pasteurella
Bước 6. Kiểm tra kỹ xem kết quả có bị lẫn lộn không
Một số vi khuẩn khó bắt màu một cách chính xác, do tính chất giòn hoặc sáp của thành tế bào của chúng. Những vi khuẩn này có thể cho thấy một hỗn hợp màu tím hoặc hồng trong cùng một tế bào, hoặc giữa các tế bào khác nhau trong cùng một vết bôi. Các mẫu vi khuẩn cũ hơn 24 giờ có thể cho thấy vấn đề này, nhưng cũng có một số loài vi khuẩn vẫn khó bắt màu ở bất kỳ độ tuổi lấy mẫu nào. Những vi khuẩn này yêu cầu các xét nghiệm chuyên biệt hơn để xác định, chẳng hạn như nhuộm nhanh bằng axit, quan sát trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn, môi trường nuôi cấy TSI hoặc xét nghiệm di truyền.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium và Propionibacterium spp. tất cả đều là vi khuẩn gram dương, nhưng thường không được nhuộm màu rõ ràng.
- Các vi khuẩn nhỏ, mảnh như Treponema, Chlamydia và Rickettsia spp. khó nhuộm bằng phương pháp Gram.
Bước 7. Vứt bỏ mọi vật tư và thiết bị còn lại
Quy trình xử lý chất thải này khác nhau giữa các phòng thí nghiệm và phụ thuộc vào vật liệu được sử dụng. Thông thường, chất lỏng trong khay nhuộm được xử lý trong các chai được dán nhãn là chất thải nguy hại. Ngâm các phiến kính trong dung dịch thuốc tẩy 10%, sau đó vứt vào thùng đựng vật sắc nhọn.
Lời khuyên
- Hãy nhớ rằng kết quả nhuộm Gram sẽ chỉ tốt nếu mẫu tốt. Điều quan trọng là phải thông báo cho bệnh nhân để họ có thể cung cấp một mẫu bệnh phẩm tốt (ví dụ: sự khác biệt giữa khạc nhổ và ho sâu để lấy mẫu đờm).
- Là một chất tẩy màu, etanol phản ứng chậm hơn axeton.
- Tuân thủ các quy định tiêu chuẩn của phòng thí nghiệm để đảm bảo an toàn.
- Dùng tăm bông ngoáy má để thực hành, vì nó chứa cả vi khuẩn gram dương và gram âm. Nếu bạn chỉ thấy một loại vi khuẩn, có thể bạn đang sử dụng quá ít hoặc quá nhiều thuốc tẩy.
- Bạn có thể sử dụng móc gỗ để cố định cầu trượt.
Cảnh báo
- Axeton và etanol là những chất dễ cháy. Axeton sẽ loại bỏ dầu trên tay của bạn, giúp da bạn dễ dàng hấp thụ các hóa chất khác. Mang găng tay và sử dụng cẩn thận.
- Không để vết bẩn khô trước khi bạn rửa sạch vết bẩn Gram hoặc chất chống thấm.
Những gì bạn cần
- Mẫu mạng
- Kính trượt
- Pipet
- Nguồn lửa nhỏ, hoặc lò sưởi trượt, hoặc metanol
- Nước
- Pha lê tím
- Iốt
- Thuốc tẩy màu, chẳng hạn như rượu hoặc axeton
- Safranin
